Cơ chế tác động là ức chế tổng hợp protein bằng cách liên kết với tiểu đơn vị ribosome 30S của các vi sinh vật nhạy cảm với
oxytetracycline, do đó
Oxytetracycline ngăn cản sự liên kết giữa ribosome và aminoacyl-tRNA. Người ta cũng tin rằng oxytetracycline liên kết ngược với ribosome 50S và làm thay đổi tính thấm của màng tế bào chất của các vi sinh vật nhạy cảm. Ở nồng độ cao, oxytetracycline cũng có thể ức chế quá trình tổng hợp protein trong tế bào.